被測的熒光物質在激發光照射下所發出的熒光，經過單色器變成單色熒光后照射于光電倍增管上，由其所發生的光電流經過放大器放大輸至記錄儀。一個激發，一個發射，采用雙單色器系統，可分別測量激發光譜和熒光光譜。
熒光光譜儀特點
（1）熒光分析的主要特點是靈敏度高、選擇性好，熒光分析的靈敏度要比吸收光譜測量高2-3個數量級。分光光度法通常在 10-7 級，而熒光的靈敏度達10-9。
（2）強選擇性強，熒光物質具有兩種特征光譜：激發光譜和吸收光譜，相對于分光光度法單一的吸收光譜來說，熒光光譜可根據激發光譜和發射光譜來鑒定物質。
（3）信息量豐富，能提供熒光物質的多種參數。
（4）但是熒光分析方法也有其不足之處：①很多物質本身不發熒光；②熒光的產生與化合物結構的關系不明確；③干擾因素多，光分解、氧淬滅、易污染。
熒光光譜儀主要用途
（1）熒光激發光譜和熒光發射光譜
（2）同步熒光（波長和能量）掃描光譜
（3）3D（Ex Em Intensity)
（4）Time Base和CWA(固定波長單點測量）
（5）熒光壽命測量，包括壽命分辨及時間分辨
（6）計算機采集光譜數據和處理數據（Datamax和Gram32)
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